書名:精編分子生物學(xué)實驗指南（精裝）作者:顏子穎出版社:科學(xué)出版社出版日期:1999年1月ISBN:7030064089頁數(shù):861開本:16市場價格:￥110元會員價格:￥110元VIP價格:￥110元贈送積分:110分版次: 1瀏覽次數(shù):1 《精編分子生物學(xué)實驗指南》是一本集現(xiàn)代分子生物學(xué)最新技術(shù)的基本原理和操作方法之大成的工具書。所收入的全是十分常用的重要方法，涉及17方面的內(nèi)容：大腸桿菌、質(zhì)粒和噬菌體，DNA制備與分析，DNA和RNA的酶促操作，RNA的制備與純化，重組DNA文庫，重組DNA文庫的篩選，DNA測序，重組DNA誘變，DNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞方法的介紹，蛋白質(zhì)分析，免疫學(xué)，DNA-蛋白質(zhì)相互作用，釀酒酵母，原位雜交與免疫組織化學(xué)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，蛋白質(zhì)表達，蛋白質(zhì)磷酸化分析等?！毒幏肿由飳W(xué)實驗指南》內(nèi)容新穎、豐富、實用，適用于從事生物、醫(yī) 學(xué)和其他與生命科學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的科研或教學(xué)人員。精編分子生物學(xué)實驗指南目錄中譯本序前言第1章大腸桿菌、質(zhì)粒和噬菌體1．l培養(yǎng)基及細菌學(xué)常用工具的準(zhǔn)備1．1．1極限培養(yǎng)基1．1．2豐富培養(yǎng)基l．1．3固體培養(yǎng)基l．1．4頂層瓊脂培養(yǎng)基1．1．5穿刺瓊脂培養(yǎng)基1．l．6實驗工具1．2在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1．2．1基本方案1過夜培養(yǎng)l．2．2基本方案2大體積培養(yǎng)1．2．3基本方案3細菌培養(yǎng)的監(jiān)測1．3在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1．3．1基本方案1通過連續(xù)稀釋法滴定和分離細菌菌落1．3．2基本方法2通過平板劃線法分離單菌落l．3．3基本方案3通過鋪平板分離單個菌落1．3．4輔助方案1影印平板1．3．5輔助方案2菌株的保存和復(fù)蘇1．4經(jīng)典細菌遺傳學(xué)選論1．5質(zhì)粒圖譜1．6質(zhì)粒DNA的小量制備1．6．1基本方案1堿裂解小量制備法1．6．2備擇方案96孔微量滴定板堿裂解法1．6．3基本方案2煮沸小皇制備法1．6．4輔助方案質(zhì)粒DNA的保存1．7質(zhì)粒DNA的大量制備1．7．1粗制裂解物的制備基本方案1堿裂解法基本方案2氯化銫／澳化乙錠平衡離心法1．7．2備擇方案利用離子交換層析和分子篩層析純化質(zhì)粒DNA1．8將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細菌細胞1．8．1基本方案ICaCl2轉(zhuǎn)化法1．8．2備擇方案一步法制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌1．8．3基本方案2高效率的電轉(zhuǎn)化方法1．9源于絲狀噬菌體的載體1．9．l絲狀噬菌體載體的發(fā)展和應(yīng)用1．9．1噬菌體衍生載體的制備和應(yīng)用基本方案利用輔助噬菌體從質(zhì)粒制備單鏈DNA第2章DNA的制備和分析2．l水溶液中DNA的純化和濃縮2．1．1基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀2．1．2備擇方案1異丙醇沉淀DNA2．1．3輔助方案1酚的平衡及酚／氯仿／異戊醇的配制2．1．4輔助方案2丁醇濃縮DNA2．1．5輔助方案3醚抽提法去除殘存酚、氯仿或丁醇2．1．6備擇方案2玻璃球法純化DNA2．1．7備擇方案3RNA及DNA稀溶液的純化和濃縮2．1．8備擇方案4乙醇沉淀法去除低分子量的寡核著酸和核著三磷酸2．2從哺乳動物組織中制備基因組DNA基本方案2．3從植物組織中制備基因組DNA2．3．1基本方案氯化銫離心法制備植物DNA2．3．2備擇方案用CTAB制備植物DNA2．4從細菌中制備基因組DNA2．4．1基本方案細菌基因組DNA的小量制備2．4．2備擇方案氯化鋁法大規(guī)模制備細菌基因組DNA2．4．3輔助方案從所得到的基因組DNA制備物中除去多糖2．SA瓊脂糖凝膠電泳2．5AI基本方案大片段DNA在瓊脂糖凝膠上的分離2．5A．2輔助方案微型凝膠及中型凝膠2．5B脈沖場凝膠電泳2．5B．l基本方案倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳2．5B2備擇方案錯位均勻電場電泳（CHEF電泳）2．5B．3輔助方案高分子量DNA樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)物的制備2．6從瓊脂糖凝膠中分離和純化大的DNA限制性酶切片段2．6．l基本方案1瓊脂糖凝膠電洗脫2．6．2基本方案2NA－45紙電泳263基本方案3用低熔點瓊脂糖凝膠分離DNA片段2．6．4備擇方案1使用B瓊脂糖酶消化法從低熔點瓊脂糖凝膠中回收DNA2．6．5備擇方案2用玻璃珠法從低熔點瓊脂糖凝膠中回收DNA2．6．6輔助方案用溴化乙錠斑點定量法對DNA濃度進行快速估測2．7非變性聚丙烯酸胺凝膠電泳2．7．1基本方案2．7．2備擇方案1通過電洗脫從聚丙烯酸胺凝膠純化片段2．7．3備擇方案2DEAE膜電洗脫法純化標(biāo)記片段2．7．4輔助方案可重復(fù)使用的用于凝膠加樣的塑料毛細管2．8篩分型瓊脂糖凝膠電泳基本方案2．9ASouthern印跡法2．9A1基本方案用高鹽緩沖液在尼龍股或硝酸纖維素膜上進行Southern印跡2．9A2輔助方案紫外透射儀的校準(zhǔn)2．9A3備擇方案1用堿性緩沖液在尼龍膜上進行Southern印跡2．9A4備擇方案2用向下毛細管轉(zhuǎn)移法進行Sauthern印跡2．9A5備擇方案3從聚丙烯酸胺凝膠至尼龍膜的電轉(zhuǎn)印法2．9BDNA的斑點和狹線印跡2．9B．1基本方案用多樣抽濾加樣器在不帶電荷的尼龍膜和硝酸纖維素膜上進行DNA斑點和狹統(tǒng)印跡2．9B．2備擇方案1用多樣抽濾加樣器在帶正電荷的尼龍膜上進行DNA斑點和狹線印跡2．9B．3備擇方案2DNA斑點印跡的手工制備210DNA印跡的雜交分析2．10．1基本方案放射性標(biāo)記的DNA探針對DNA印跡的雜交分析2．10．2備擇方案用放射性標(biāo)記的RNA探針對DNA印跡進行雜交分析2．10．3輔助方案從雜交膜上除去探針2．11變性聚丙烯酸胺凝膠電泳純化寡核著酸基本方案第3章DNA和DRNA的酸學(xué)操作3．1限制性內(nèi)切酶消化DNA3．1．1基本方案單酶單DNA樣品消化3．1．2備擇方案1多限制性內(nèi)切酶消化DNA樣品3．1．3備擇方案2消化多個DNA樣品3．1．4備擇方案3限制性內(nèi)切酶對DNA樣品的部分消化3．1．5輔助方案DNA的甲基化3．2用多種酶消化進行DNA作圖基本方案3．3用限制酶部分消化進行DNA作圖基本方案3．4核酸操作的常用試劑和放射性同位素3．4．l貯液3．4．210X酶緩沖液3．4．3酶反應(yīng)條件及應(yīng)用3．4．4核苷三磷酸（NTP）3．4．5標(biāo)記核酸的放射性同位素基本方案酸沉淀法測定DNA和RNA中的放射性備擇方案柱離心法分離放射性標(biāo)記DNA3．5依賴于DNA的DNA聚合酶3．51大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段基本方案1標(biāo)記DNA的3末端基本方案2修復(fù)突出的3或5末端以產(chǎn)生平端基本方案3隨機寡核著酸引物介導(dǎo)的DNA標(biāo)記Klenow酶的其他應(yīng)用3．5．2T4DNA聚合酶3．5．3天然T7DNA聚合酶3．5．4經(jīng)修飾的T7DNA聚合酶3．5．sTaqDNA聚合酶3．6不依賴于模板的DNA聚合酶末端脫氧核著酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）37依賴RNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶3．8依賴DNA的RNA聚合酶．噬菌體的RNA聚合酶：SP6、T7和T33．9不依賴DNA的RNA聚合酶POly（A）聚合酶3．10磷酸酶和激酶3．10．1堿性磷酸酶3．10．2T4多核著酸激酶基本方案1正向反應(yīng)標(biāo)記5端基本方案2交換反應(yīng)標(biāo)記5端其他應(yīng)用3．11外切核酸酶3．11．l單鏈5一3和3一5外切核酸酶3．11．2雙鏈5一3味端外切核酸酶3．11．3雙鏈3一5外切核酸酶3．12內(nèi)切核酸酶．3．12．1Bal31核酸酶．3．12．2SI核酸酶3．12．3綠豆核酸酶3．12．4微球菌核酸酶3．12．5脫氧核糖核酸酶1（DNaseI）．3．13核糖核酸酶．3．13．1核糖核酸酶A（RNaseA）．3．13．2核糖核酸酶H3．13．3核糖核酸酶T13．14DNA連接酶3．141T4DNA連接酶3．14．2大腸桿菌DNA連接酶3．15RNA連接酶T4RNA連接酶3．16DNA片段的亞克隆3．161基本方案3．16．2備擇方案凝膠塊中DNA片段的連接3．17聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建重組DNA基本方案DNA片段亞克隆3．18非同位素探針的標(biāo)記和比色檢測3．18．l基本方案1用切口平移法制備生物素酸化的探針3．18．2基本方案2用隨機寡核青酸引物合成法制備生物素酸化探針3．18．3輔助方案生物素酸化探針的比色法檢測3．18．4備擇方案制備和檢測地高辛標(biāo)記的DNA探針f3．19非同位素探針的化學(xué)發(fā)光檢測3．19．1基本方案生物素標(biāo)記探針的化學(xué)發(fā)光檢測＠3．19．2備擇方案地高辛標(biāo)記探針的化學(xué)發(fā)光檢測3．19．3輔助方案紫外光源的標(biāo)化第4章RNA的制備和分析4．l從組織培養(yǎng)細胞中提取細胞質(zhì)RNA4．1．1基本方案4．1．2輔助方案除去混雜的DNA污染4．2異硫氰酸弧法制備總RNA4．2．l基本方案CaCl法純化從培養(yǎng)細胞中提取的RNA4．2．2備擇方案1CaCl純化組織RNA4．2．3備擇方案2從組織或培養(yǎng)細胞中一步法分離RNA4．3酚／SDS法制備植物RNA基本方案4．4制備細菌RNA4．4．1基本方案1從革蘭氏陰性細菌中分離高質(zhì)量的RNA4．4．2基本方案2從革蘭氏陽性細菌分離RNA4．4．3備擇方案從革蘭氏陰性菌中快速分離RNA4．5paly（A）+RNA的制備基本方案4．6用單鏈DNA探針進行mRNA的S1核酸酶作圖分析4．61基本方案用MI3模板進行mRNA的S1作圖4．62備擇方案1從雙鏈模板合成單鏈探針4．6．3備擇方案2用寡核著酸探針進行mRNA的定量S1作圖分析4．6．4輔助方案SI核酸酶mRNA定量分析的實驗對照4．7核酸酶保護試驗4．7．1基本方案4．7．2輔助方案1RNA探針的提純4．7．3輔助方案2模板DNA的制備4．8引物延伸基本方案4．9RNA的Narthern印跡和狹線雜交分析4．9．l基本方案甲醛一瓊脂精凝膠電泳分離RNA的Narthern雜交，4．9．2備擇方案1經(jīng)戊二醛／二甲基亞礬變性處理的RNA的Narthern雜4．9．3備擇方案2經(jīng)狹線印跡固定的未分級RNA樣品的Northern雜交第5章重組DNA文庫的構(gòu)建5．1基因組DNA文庫概述5．1．1表現(xiàn)度與隨機性5．1．2亞基因組文庫5．1．3基因組DNA文庫載體5．2cDNA文庫概述5．3噬菌體文庫的擴增基本方案5．4粘粒和質(zhì)粒文庫的擴增 基本方案第6章重組DNA文庫的篩選6．1噬菌體文庫的鋪平板和轉(zhuǎn)移基本方案6．2粘粒及質(zhì)粒文庫的鋪平板和轉(zhuǎn)移基本方案6．3應(yīng)用DNA片段作探針6．3．l基本方案在甲酸胺溶液中進行雜交6．3．2備擇方案在水溶液中進行的雜交6．4使用合成寡核著酸作探針6．4．1基本方案1在氯化鈉／檸檬酸鈉溶液（SSC）中雜交6．4．2基本方案2在氯化四甲銨（TMAC）中雜交6.4.3輔助方案混合寡核苷酸5末端標(biāo)記6．5噬菌體克隆的純化基本方案6．6粘粒和質(zhì)?？寺〉募兓痉桨?．7在人噬菌體噬斑中產(chǎn)生的融合蛋白的免疫篩選6．7．1基本方案用抗體篩選人gtll表達文庫6．7．2備擇方案在抗體篩選之前用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達6．8在雜交選擇和翻譯后進行的免疫篩選某本方案6．9概述篩選YAC文庫和分析YAC克隆的策略6．9．1YAC文庫的構(gòu)建6．9．2中心實驗室的YAC文庫篩選6．9．3篩選用的基因座特異性PCR試驗的設(shè)計6．9．4分析獨立的YAC克隆6．9．5YAC插入片段的亞文庫的構(gòu)建與分析6．10對分離得到的YAC克隆的分析6．10．l基本方案1含YAC的酵母菌株的培養(yǎng)和保存6．10．2基本方案2制備YACDNA進行Southern印跡分析6．10．3基本方案3制備用于脈沖電場凝膠電泳的包理于瓊脂糖膠塊中的酵母染色體6．10．4基本方案4用PCR擴增法進行末端片段分析6．10．5備擇方案采用亞克隆至細菌質(zhì)粒載體中分析末端片段6．10．6輔助方案設(shè)計和制備pUC19－ES和pUC19－HS亞克隆載體6．10．7基本方案5制備高分子量的含YAC的酵母DNA6．10．8基本方案6制備和分析YAC插入片段的亞文庫7．0DNA測序方法概述．7．0．1雙脫氧測序（Sanger法）7．0．2化學(xué)測序（Maxam－Gi比ert法）7．0．3雙脫氧法或化學(xué)測序法的選擇7．0．4放射性標(biāo)記測序反應(yīng)的備擇標(biāo)記7．1DNA測序策略．；7．1．l雙脫氧測序．；7．1．2化學(xué)測序7．2構(gòu)建用于DNA測序的嵌套式缺失突變體7．2．l基本方案1用外切酶Ill構(gòu)建單向缺失突變體7．2．2輔助方案1用[a－35]dNTP使DNA免于外切酶III消化7．2．3基本方案2用Ba131核酸酶構(gòu)建嵌套式缺失突變體7．2．4輔助方案制備M13mp測序載體以亞克隆Ba131消化的DNA片段7．3制備DNA測序模板7．3．1基本方案1制備單鏈M13噬菌體DNA7．3．2基本方案2從小量裂解物中制備人噬菌體DNA7．3．3基本方案3小量制備用于雙脫氧測序的雙鏈質(zhì)粒DNA模板7．3．4基本方案4用于雙脫氧測序的雙鏈質(zhì)粒DNA的堿變性7．3．5基本方案5制備用于熱循環(huán)測序質(zhì)?；蚴删wDNA7．4雙脫氧法DNA測序7．4．l基本方案1用測序酶進行標(biāo)記／終止測序反應(yīng)7．4．2備擇方案1使用Mn2+的標(biāo)記／終止反應(yīng)7．4．3備擇方案2使用TaqDNA聚合酶進行Sanger雙脫氧測序7．4．4備擇方案3用5末端標(biāo)記引物一步法進行測序反應(yīng)7．4．5基本方案2用標(biāo)記核昔酸進行熱循環(huán)測序反應(yīng)7．4．6備擇方案4用5末端標(biāo)記引物進行熱循環(huán)測序反應(yīng)7．5化學(xué)發(fā)光雙脫氧DNA測序法7．5．1基本方案利用生物素標(biāo)記引物的化學(xué)發(fā)光DNA測序法7．5．2備擇方案1鏈親和素和生物素酸化堿性磷酸酶兩步檢測法（間接法）7．5．3備擇方案2用半抗原標(biāo)記引物進行測序并用抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物進行檢測7．6用于測序的變性凝膠電泳7．6．1基本方案測序膠的灌制、電泳及處理7．6．2備擇方案l緩沖液梯度測序膠7．6．3備擇方案2電解質(zhì)梯度測序膠7．6．4備擇方案3含甲酸胺的測序膠－7．7DNA和蛋白質(zhì)序列的計算機處理和分析7．7．1序列數(shù)據(jù)的錄入7．7．2序列數(shù)據(jù)的確證和組裝7．7．3限制酶作圖 7．7．4核酸結(jié)構(gòu)預(yù)測7．7．5寡核著酸設(shè)計策略7．7．6蛋白質(zhì)編碼區(qū)的識別7．7．7同源性檢索7．7．8向分子生物學(xué)家提供的基因序列庫及其他計算機資源附錄第8章克隆化DNA的誘變8．1無需表型選擇的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變基本方案8．2A用簡并寡核苷酸誘變：在小段DNA序列中產(chǎn)生大量突變基本方案8．ZB基因合成：用互為引物的長段寡核著酸合成目的序列基本方案8．3區(qū)域特異性誘變8．3．1基本方案8．3．2輔助方案突變克隆的富集8．4DNA的接頭分區(qū)誘變8．4．l輔助方案用嵌套缺失體和互補寡核著酸進行接頭分區(qū)誘變8．4．2備擇方案寡核著酸介導(dǎo)的接頭分區(qū)誘變8．5利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的定點誘變8．5．l基本方案1通過PCR引人限制性內(nèi)切酶位點8．5．2基本方案2利用PCR引入點突變8．5．3備擇方案通過順序PCR步驟引入點突變 第9章DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞 9．1磷酸鈣轉(zhuǎn)染法9．1．l基本方案磷酸鈣-DNA在HEPES中形成沉淀的轉(zhuǎn)染方法9．1．2輔助方案l哺乳動物細胞的甘油／二甲基亞砜7休克9．1．3備擇方案在BES中形成磷酸鈣-DNA沉淀的高效轉(zhuǎn)染方法9．1．4輔助方案2質(zhì)粒DNA的純化9．2利用DEAE-葡聚精的轉(zhuǎn)染9．2．1基本方案9．2．2備擇方案1DEAE-葡聚糖大批量轉(zhuǎn)染9．2．3備擇方案2懸浮細胞的轉(zhuǎn)染9．2．4備擇方案3用氯險處理細胞9．3電穿孔轉(zhuǎn)染法9．3．l基本方案電穿孔法轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞9．3．2備擇方案植物原生質(zhì)體細胞的電穿孔轉(zhuǎn)染9．4脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染9．4．l基本方案用脂質(zhì)體介導(dǎo)短暫表達9．4．2備擇方案用脂質(zhì)體進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染9．5將基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞9．5．l基本方案9．5．2哺乳動物細胞的選擇標(biāo)記9．6遺傳報道基因系統(tǒng)概述9．6．l報道載體的設(shè)計9．6．2體外報道分子分析方法9．63體內(nèi)報道分子分析方法9．7A報道基因活性的同位素分析方法9．7A．1基本方案1CAT活性的層析分析法9．7A．2備擇方案1原位裂解細胞的CAT分析方法9．7A．3備擇方案2CAT活性的相一抽提分析法9．7A．4基本方案2人生長激素的放射免疫分析法9．7B非同位素分析報道基因活性9．7B．l基本方案1螢火蟲熒光素酶報道基因分析9．7B．2備擇方案凍融裂解的細胞的熒光素酶分析9．7B．3基本方案2b-半乳精著酶報道基因的化學(xué)發(fā)光分析9．8轉(zhuǎn)染后RNA的直接分析9．8．l轉(zhuǎn)染效率9．8．2RNA制備9．8．3RNA分析9．8．4啟動子強度9．9轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化9．9．1DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法9．9．2磷酸鈣轉(zhuǎn)染法9．9．3電穿孔法9．9．4脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染9．10反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)概述9．10．1反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期9．10．2無復(fù)制能力的載體9．103有復(fù)制能力的載體9．10．4包裝細胞系和病毒的產(chǎn)生9．10．5安全性問題9．11建立特異的反轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)毒細胞系9．11．l基本方案1將反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入包裝細胞系gll．2基本方案2測定病毒滴度：高滴度產(chǎn)病毒細胞克隆的鑒定9．11．3備擇方案產(chǎn)毒克隆的快速評價9．11．4輔助方案培養(yǎng)細胞的Xgl染色9．12大規(guī)模制備和濃縮反轉(zhuǎn)錄病毒原液9．12．l基本方案用離心法制備和濃縮病毒原液9．12．2備擇方案用聚乙二醇均相沉淀及層析法濃縮病毒．．9．12．3備擇方案用分子量截留濾膜進行濃縮9．13反轉(zhuǎn)錄病毒原液中輔助病毒的檢測9．13．l基本方案通過藥物抗性的水平傳播分析輔助病毒9．13．2備擇方案用反轉(zhuǎn)錄酶分析法檢測輔助病毒9．14用反轉(zhuǎn)錄病毒在體外及體內(nèi)感染細胞9．14．1體外細胞感染9．14．2在體內(nèi)感染嚙齒類動物第互0章蛋白質(zhì)的分析10．1比色法測定蛋白質(zhì)含量．基本方案Bradford法10．2蛋白質(zhì)的單向SDS凝膠電泳10．2．l電與電泳10．2．2基本方案1變性（SDS）不連續(xù)凝膠電泳：Laemmh凝膠電泳法10．23備擇方案1在Tris－Tricine緩沖系統(tǒng)中電泳10．2．4備擇方案2在無尿素條件下用Tris緩沖液分離多肽10．2．5備擇方案3連續(xù)SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳102．6備擇方案4超薄凝膠的灌制和電泳10．2．7輔助方案1一次灌制多塊濃度均一的凝膠10．2．8備擇方案5在梯度凝膠中分離蛋白質(zhì)102．9輔助方案2一次灌制多塊梯度膠10．2．10基本方案2在均一濃度的微型凝膠上電泳10．2．11輔助方案3制備多塊梯度膠10．3使用OFarrell系統(tǒng)的雙向凝膠電泳10．3．l基本方案1第l向凝膠（等電聚焦）10．3．2基本方案2第2向凝膠10．3．3備擇方案1、2（第1向凝膠電泳）極端堿性、酸性蛋白的等電聚焦10．3．4備擇方案3小型凝膠雙向電泳10．3．5輔助方案組織來源的蛋白質(zhì)樣品的溶解和制備10．4從已染色的凝膠中電洗脫回收蛋白質(zhì)基本方案10．5凝膠中蛋白質(zhì)的染色1051基本方案1考馬斯亮藍染色10．5．2基本方案2銀染法10．5．3備擇方案非氨鹽銀染法10．5．4基本方案3快速銀染法10．5．5輔助方案凝膠拍照10．6檢測轉(zhuǎn)印到股上的蛋白質(zhì)10．6．l基本方案印度墨汁染色10．6．2備擇方案金染色10．6．3輔助方案堿處理增強蛋白質(zhì)的染色10．7免疫印跡與免疫檢測10．7．1基本方案1用轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)10．7．2備擇方案1用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)10．7．3輔助方案轉(zhuǎn)印后蛋白質(zhì)的可逆染色10．7．4基本方案2用第H抗體偶聯(lián)物進行免疫檢測10．7．5備擇方案2用親和素一生物素偶聯(lián)的第二抗體進行免疫檢測10．7．6基本方案3用發(fā)色底物顯跡10．7．7備擇方案3用發(fā)光底物顯跡10．8凝膠過濾層析10．8．1基本方案蛋白質(zhì)的凝膠過濾分離10．8．2備擇方案蛋白質(zhì)的凝膠過濾脫鹽10．8．3輔助方案凝膠介質(zhì)和層析柱的選擇10．9離子交換層析10．9．l基本方案10．9．2輔助方案離子交換層析介質(zhì)和層析柱的選擇10．10免疫親和層析10．10．1基本方案可溶性抗原或膜結(jié)合抗原的分離10．10．2備擇方案1抗原的批處理純化10．10．3備擇方案2低pH洗脫抗原10．11金屬螫合親和層析10．11．l基本方案天然MCAC純化帶組氨酸尾的可溶性融合蛋白10．11．2備擇方案1變性條件下用MCAC純化帶組氨酸尾的不溶性融合蛋白10．11．3備擇方案2MCAC純化蛋白的固相復(fù)性10．11．4輔助方案1已純化蛋白的分析和處理10．11．5輔助方案2NTA介質(zhì)的再生10．12反相高效液相層析10．12．l基本方案多肽和蛋白質(zhì)的分離10．12．2備擇方案蛋白質(zhì)的分離10．12．3輔助方案水、緩沖液和溶劑的脫氣10．13離子交換高效液相層析10．13．l基本方案1陰離子交換HPLC10．13．2基本方案2陽離子交換HPLC10．14分子排阻高效液相層析基本方案10．15免疫沉淀法10．15．l基本方案用抗體一SePharose偶聯(lián)物免疫沉淀放射性標(biāo)記抗原10．15．2輔助方案制備抗體一Sepharose偶聯(lián)物10．15．3備擇方案1用抗Ig血清免疫沉淀放射性標(biāo)記抗原10．15．4備擇方案2用抗Ig抗體一SePharosc、蛋白A-或蛋白G－Sepharose或金黃色葡萄球菌（S．a(chǎn)ureus）免疫沉淀放射性標(biāo)記抗原10．15．5備擇方案3使用更劇烈的解離和洗滌條件的免疫沉淀10．15．6備擇方案4用抗體七ePharose瓊脂精偶聯(lián)物免疫沉淀非標(biāo)記抗原10．16克隆化基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯基本方案10．17蛋白質(zhì)的生物合成標(biāo)記、10．17．1基本方案用［ S]甲硫氨酸短時間標(biāo)記懸液中的細胞10．17．2備擇方案1用［S]引甲硫氨酸短時間標(biāo)記貼壁培養(yǎng)細胞10．17．3備擇方案2用［S甲硫氨酸長時間標(biāo)記細胞10．17．4備擇方案3用［ S]甲硫氨酸對細胞進行脈沖追蹤標(biāo)記10．17．5備擇方案4用其他氨基酸進行生物合成標(biāo)記10．17．6輔助方案TCA沉淀法確定放射性標(biāo)記的摻入量10．18分離蛋白質(zhì)用于微量序列分析10．181基本方案1測定在PVDF膜上樣品的氨基酸序列10．18．2輔助方案SDS－PAGE準(zhǔn)備蛋白質(zhì)樣品10．18．3基本方案2測定N-末端封閉蛋白質(zhì)的內(nèi)部序列第11章免疫字11．1酶與抗體的偶聯(lián)11．1．l基本方案辣根過氧化物酶（HRPO）與抗體的偶聯(lián)11．1．2備擇方案堿性磷酸酶與抗體的偶聯(lián)11．2酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）11．2．l基本方案用間接ELISA法檢測特異性抗體11．2．2備擇方案1直接競爭ELISA法檢測可溶性抗原11．2．3備擇方案2抗體夾心ELISA法檢測可溶性抗原11．2．4備擇方案3雙抗體夾心ELISA法檢測特異性抗體11．2．5備擇方案4直接細胞ELISA法檢測細胞表面抗原11．2．6備擇方案5間接細胞ELISA法檢測對表面抗原具有特異性的抗體11．2．7輔助方案l交叉連續(xù)稀釋法確定最佳試劑濃度11．2．8輔助方案2制備細菌細胞裂解物抗原11．3單克隆抗體上清液和腹水的制備11．3．1基本方案1單克隆抗體上清的制備11．3．2備擇方案1單克隆抗體上清的大量制備11．3．3備擇方案2大量制備雜交瘤或細胞系11．3．4基本方案2含單克隆抗體的腹水的制備 11．4單克隆抗體的純化11．4．1基本方案用蛋白A－SephArOsc進行純化11．4．2備擇方案1蛋白A－SePhArOse的備擇緩沖液系統(tǒng)11．4．3備擇方案2用抗原一SePhArOse和抗鼠Ig－SePhArOsc進行純化11．5兔多克隆抗血清的制備11．5．l基本方案肌肉內(nèi)注射免疫法11．5．2備擇方案1皮內(nèi)注射免疫法11．5．3備擇方案2皮下組織注射免疫法11．5．4備擇方案3耳動脈放血11．6從抗血清、腹水或雜交瘤上清液中純化IgG抗體11．6．1基本方案用硫酸鉸沉淀IgG11．6．2備擇方案用DEAE－Affi－Gel－Blue層析法分級分離IgG11．7免疫原性肽的選擇11．8抗肽抗體的制備11．8．墓基本方案通過化學(xué)偶聯(lián)法用MBS將合成肽偶聯(lián)到擔(dān)體蛋白上11．8．2備擇方案用戊二醒將合成肽通過化學(xué)偶聯(lián)法偶聯(lián)到擔(dān)體蛋白質(zhì)上第12章DNA-蛋白質(zhì)相巨作用12．1從哺乳動物細胞中制備核提取物和細胞質(zhì)提取物12．1．1基本方案核提取物的制備12．1．2輔助方案1細胞核提取方法的優(yōu)化12．1．3輔助方案2細胞質(zhì)（S－100）組分的制備12．2DNA結(jié)合蛋白在凝膠電泳中的遷移率變動分析12．2．1基本方案低離子強度聚丙烯酸胺電泳遷移率變動分析12．2．2備擇方案高離子強度聚丙烯酸胺電泳遷移率變動分析12．3甲基化干擾分析法和尿嘧啶干擾分析法12．3．l基本方案1甲基化干擾分析法12．3．2基本方案2尿嘧啶干擾分析法12．4DNA酶I足跡分析法12．4．1基本方案DNA酶1足跡分析法12．4．2輔助方案用光密度及數(shù)值分析法決定蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡常數(shù)12．4．3備擇方案粗制品的DNA酶1足跡分析法12．5蛋白質(zhì)與核酸的紫外交聯(lián)12．5．l基本方案用澳脫氧尿苷（BrdU）取代的探針進行紫外交聯(lián)12．5．2備擇方案1用非澳脫氧尿苷（NON－BrdU）取代的探針進行紫外交聯(lián)12．5．3備擇方案2原位紫外交聯(lián)12．6用生物素／鏈親和素親和系統(tǒng)純化DNA結(jié)合蛋白12．6．1基本方案12．6．2備擇方案1用微型柱進行純化12．6．3備擇方案2用鏈親和素-瓊脹糖進行純化12．7編碼DNA結(jié)合蛋白的cDNA的檢測、純化和鑒定12．7．1基本方案用識別位點DNA篩選gtll表達文庫12．7．2備擇方案干燥膜的變性／復(fù)性12．7．3輔助方案從重組溶原菌中制備粗提物鑒定DNA結(jié)合蛋白的活性12．8用體外合成的蛋白質(zhì)分析DNA蛋白質(zhì)相互作用基本方案12．9序列特異性DNA結(jié)合蛋白的親和層析純化12．9．1基本方案1DNA親和介質(zhì)的制備12．9．2備擇方案將DNA偶聯(lián)于漬化氰活化瓊脂精上12．9．3輔助方案1用制備性凝膠電泳純化寡核苷酸12．9．4基本方案2DNA親和層析法12．9．5輔助方案2非同位素競爭性DNA的選擇和制備第13章釀酒酵母．；13．1酵母菌培養(yǎng)基的制備13．1．1液體培養(yǎng)基13．1．2固體培養(yǎng)基13．1．3菌株的保存與復(fù)蘇 基本方案冷凍菌種保存液的制備與接種13．2酵母菌的培養(yǎng)與操作13．2．1基本方案1液體培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌13．2．2基本方案2固體培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌13．2．3基本方案3細胞密度檢測13．2．4基本方案4影印平板檢測酵母菌表型13．2．5基本方案5H倍體細胞的構(gòu)建13．2．6基本方案6Th倍體細胞的泡子形成13．2．7基本方案7四分體的制備與剖分13．2．8輔助方案解剖針的制作13．2．9備擇方案隨機炮子分析13．3酵母菌細胞的誘變13．3．1基本方案甲乙硫醚誘變13．3．2備擇方案紫外光誘變13．4酵母菌的克隆載體與基因圖譜13．4．l質(zhì)粒分類命名13．4．2精選的質(zhì)粒和基因圖譜，13．5酵母菌表達載體13．6酵母菌載體與表達產(chǎn)物的檢測13．6．1基本方案1研究基因調(diào)控的切cZ融合載體13．6．2基本方案2卜半乳糖著酶在液體培養(yǎng)基中的表達與檢測13．7將DNA導(dǎo)入酵母菌細胞中13．71基本方案乙酸鋰轉(zhuǎn)化13．7．2備擇方案1原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化13．7．3備擇方案2電穿孔轉(zhuǎn)化13．74輔助方案單鏈高分子量的擔(dān)體DNA的制備13．8利用互補作用克隆酵母菌基因基本方案13．9酵母細胞的質(zhì)粒分離除去基本方案13．10克隆化酵母DNA的操作13．10．1基本方案1整合性轉(zhuǎn)化 13．10．2基因置換技術(shù)基本方案2整合性破壞 基本方案3基因破壞一步法基本方案4移換13．10．3基本方案5質(zhì)粒缺口修復(fù)13．10．4基本方案6穿梭質(zhì)粒13．11酵母DNA的制備13．11．1基本方案從酵母菌中快速分離質(zhì)粒DNA1311．2備擇方案酵母染色體DNA的快速分離13．12酵母菌RNA的制備13．12．1基本方案熱酸性酚抽提法制備酵母RNA13．12．2備擇方案1玻璃珠法制備RNA13．12．3備擇方案2paly（A）+RNA的制備13．13制備酵母蛋白抽提物．13．13．l基本方案原生質(zhì)體制備及裂解13．13．2輔助方案差速離心法制備細胞核13．13．3備擇方案1玻璃球破細胞法13．13．4備擇方案2液氮破細胞法13．14利用相互作用阱／雙雜合系統(tǒng)確定相互作用的蛋白質(zhì)13．14．1基本方案1鑒定誘餌蛋白的特性13．14．2基本方案2相互作用蛋白的捕獲13．14．3輔助方案1制備鮭精擔(dān)體DNA13．14．4輔助方案2附加的特異性篩選方法第14章原位雜交和免疫組織化學(xué)14．1組織、胚胎及單細胞的固定、包理及切片14．1．l基本方案組織和胚胎的多聚甲醛固定及石蠟包理14．1．2備擇方案懸浮及培養(yǎng)細胞的PFA固定14．1．3輔助方案1成年小鼠的灌流14．1．4輔助方案2蠟塊中樣品的切片14．1．5輔助方案3預(yù)包被載玻片的處理14．2冰凍切片14．2．l基本方案樣品制備及切片14．2．2輔助方案1用于原位雜交的冰凍切片的固定14．2．3輔助方案2組織固定和蔗糖浸制14．3細胞RNA的原位雜交174．3．l基本方案石蠟切片或細胞的雜交實驗14．3．2備擇方案冰凍切片的雜交實驗14．3．3輔助方案lS標(biāo)記的核糖核酸探針和含硫探針競爭劑護14．3．4輔助方案2S標(biāo)記的雙鏈DNA探針的合成14．4雜交探針的檢測14．4．l基本方案1膠片放射自顯影14．4．2基本方案2膠乳放射自顯影14．4．3輔助方案放射自顯影用稀釋膠乳的制備14．5放射自顯影原位雜交玻片的復(fù)染和壓片固定14．5．l基本方案吉姆薩（Giemsa）染色法14．5．2備擇方案1蘇木精／伊紅染色法14．5．3備擇方案2甲苯胺藍染色法14．5．4備擇方案3HOECHST染色法14．6免疫組織化學(xué)法14．6．1基本方案l單層生長細胞的免疫熒光標(biāo)記14．6．2備擇方案1懸浮細胞的免疫熒光標(biāo)記14．6．3基本方案2組織切片的免疫熒光標(biāo)記14．6．4備擇方案2鏈親和素一生物素結(jié)合物免疫熒光標(biāo)記法14．6．5備擇方案3組織切片的免疫金標(biāo)記14．6．6備擇方案4組織切片的免疫過氧化物酶標(biāo)記14．6．7備擇方案5組織切片的免疫熒光雙標(biāo)記法14．7用非同位素探針進行原位雜交和檢測14．7．l基本方案1熒光原位雜交14．7．2雜交信號的放大輔助方案1生物素酸化信號的放大輔助方案2地高辛標(biāo)記探針的信號放大14．7．3非同位素標(biāo)記探針的酶法檢測備擇方案1辣很過氧化物酶法檢測備擇方案2堿性磷酸酶檢測法14．8低豐度核酸的檢測：原位PCR和雜交14．8．l總體設(shè)計14．8．2基本方案1DNA和RNA靶序列的原位PCR擴增14．8．3備擇方案一步法反轉(zhuǎn)錄及擴增14．8．4基本方案2ISPCR擴增的產(chǎn)物的雜交和檢測14．8．5輔助方案1AES浸泡處理載玻片的制備14．8．6輔助方案2在載玻片上制備康位PCR樣品14．8．7輔助方案3用P標(biāo)記寡核苷酸探針第互5章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）15．1PCR擴增DNA：標(biāo)準(zhǔn)程序和優(yōu)化基本方案15．2利用PCR產(chǎn)物直接進行DNA序列測定15．2．1基本方案1不對稱PCR產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物的雙脫氧測序15．2．2備擇方案1單引物重復(fù)擴增制備單鏈模板以用于雙脫氧測序15．2．3備擇方案2制備用于雙脫氧測序的雙鏈PCR產(chǎn)物15．2．4備擇方案3用人噬菌體核酸外切酶消化雙鏈PCR產(chǎn)物得到單鏈進行雙脫氧測序15．2．5基本方案2PCR產(chǎn)物的標(biāo)記和化學(xué)測序15．2．6備擇方案4PCR產(chǎn)物的基因組測序15．3通過PCR方法對微量DNA進行定量分析基本方案15．4PCR擴增RNA15．4．l基本方案在最適條件下進行RNA的PCR擴增15．4．2備擇方案1避免長時間的共沉淀及退火步驟的方法15．4．3備擇方案2將cDNA直接用于擴增反應(yīng)15．4．4輔助方案粗制RNA的快速提取15．5用于基因組測序及足跡分析的連接介導(dǎo)PCR15．5．l基本方案連接介導(dǎo)的單側(cè)PCR15．5．2輔助方案1從單層細胞制備基因組DNA以用于DMS足跡分析15．5．3輔助方案2從懸浮細胞中制備用于DMS足跡分析的基因15．5．4輔助方案3用于化學(xué)測序的基因組DNA的制備15．6利用單側(cè)PCR（鋪式PCR）進行cDNA擴增15．6．1基本方案1擴增已知序列的下游（端）區(qū)段15．6．2基本方案2擴增已知序列上游（5端）區(qū)段15．7PCR產(chǎn)物的分子克隆15．7．l基本方案產(chǎn)生T－A突出端15．7．2備擇方案1產(chǎn)生半位點15．8通過PCR差異展示mRNA基本方案第16章蛋白質(zhì)的表達16．1概述：蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達16．1．1用大腸桿菌進行基因表達的一般策略16．1．2特定的表達方案16．1．3基因表達的疑難分析16．2T7RNA聚合酶／啟動子表達系統(tǒng)16．2．1基本方案用雙質(zhì)粒系統(tǒng)進行表達16．2．2備擇方案1質(zhì)粒編碼蛋白的選擇性標(biāo)記16．2．3備擇方案2通過M13噬菌體mGP1-2感染的表達16．3用帶入噬菌體調(diào)節(jié)序列的載體進行表達16．3．1基本方案1基因表達的溫度誘導(dǎo)16．3．2基本方案2基因表達的化學(xué)誘導(dǎo)16．3．3輔助方案1用pSKF系列載體進行天然基因克隆16．3．4輔助方案2融合基因在PSKF301中的構(gòu)建和拆分16．4融合蛋白載體表達概述16．4．1表達蛋白的可溶性16．4．2表達蛋白的穩(wěn)定性16．4．3裂解融合蛋白以除去擔(dān)體蛋白16．5融合蛋白的酶解和化學(xué)裂解16．5．l基本方案1用Xa因子進行融合蛋白的酶解16．5．2輔助方案用Xa因子進行變性融合蛋白的裂解16．5．3備擇方案1用凝血酶進行融合蛋白的酶解16．5．4備擇方案2與分離介質(zhì)結(jié)合的GST融合蛋白的酶解16．5．5備擇方案3用腸激酸進行融合蛋白的酶解16．5．6基本方案2用溴化氰對融合蛋白進行化學(xué)降解16．5．7備擇方案4用羥胺化學(xué)裂解融合蛋白16．5．8備擇方案5低PH下水解融合蛋白進行化學(xué)裂解16．6lacZ和trpE融合蛋白的表達及純化基本方案16．7谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的表達及純化基本方案16．8硫氧還蛋白融合蛋白的表達和純化16．8．1基本方案硫氧還蛋白融合蛋白的構(gòu)建和表達16．8．2輔助方案1用弗氏細胞壓碎器裂解大腸桿菌16．8．3輔助方案2硫氧還蛋白融合蛋白的滲透性釋放16．8．4輔助方案3用熱處理純化硫氧還蛋白融合蛋白16．9桿狀病毒表達系統(tǒng)的概述16．9．l桿狀病毒表達系統(tǒng)16．9．2昆蟲細胞中蛋白質(zhì)的翻譯后修飾16．9．3用桿狀病毒表達系統(tǒng)超量表達蛋白的步驟16．9．4用于桿狀病毒表達系統(tǒng)的試劑、溶液和設(shè)備16．10昆蟲細胞培養(yǎng)物及桿狀病毒毒種貯液的制備16．10．l基本方案1昆蟲細胞的保存和培養(yǎng)1610．2基本方案2桿狀病毒毒種貯液的制備16．10．3輔助方案用蝕斑試驗測定病毒貯液的滴度，16．11重組桿狀病毒的產(chǎn)生和重組蛋白的表達分析16．11．1基本方案1用野生型病毒線性化DNA共轉(zhuǎn)染16．11．2備擇方案用野生型病毒環(huán)狀DNA共轉(zhuǎn)染16．11．3輔助方案1野生型桿狀病毒的純化16．11．4基本方案2編碼b-半乳糖甘醇的重組桿狀病毒的純化16．11．5輔助方案2裸眼篩選重組桿狀病毒16．11．6基本方案3重組病毒的蛋白質(zhì)分析16．11．7輔助方案3重組蛋白質(zhì)的代謝標(biāo)記16．11．8輔助方案4蛋白質(zhì)生產(chǎn)高峰期的確定16．11．9基本方案4重組蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)16．12概述：蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中表達16．12．l病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移16．12．2短暫表達16．12．3DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染16．12．4轉(zhuǎn)染DNA的擴增16．12．5表達載體16．12．6表達系統(tǒng)的選擇16．12．7問題的發(fā)現(xiàn)與解決16．13用COS細胞短暫表達蛋白質(zhì)基本方案第17章蛋白質(zhì)磷酸化的分析17．1蛋白質(zhì)磷酸化概述17．2培養(yǎng)細胞用于；標(biāo)記和用于免疫沉淀的細胞裂解物的制備17．2．1基本方案培養(yǎng)細胞的P1標(biāo)記和溫和去污劑裂解法17．2．2備擇方案SDS煮沸法裂解細胞17．3磷酸氨基酸分析17．3．1基本方案磷酸氨基酸的酸水解和雙向電泳分析17．3．2備擇方案堿處理提高轉(zhuǎn)移至濾膜上的磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸的檢測17．4分析非標(biāo)記蛋白質(zhì)的磷酸化作用17．4．l基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗體和[I]標(biāo)記蛋白A進行免疫印跡分17．4．2備擇方案用增強化學(xué)發(fā)光潔（ECL）檢測結(jié)合的抗體17．4．3基本方案2磷酸酶消化法鑒定磷酸化的蛋白質(zhì)附錄附錄1試劑和溶液附錄2標(biāo)準(zhǔn)測量值、數(shù)據(jù)和縮寫常用縮寫實用測量值和數(shù)據(jù)核酸的特性放射性離心機和轉(zhuǎn)子附錄3生物化學(xué)和分子生物學(xué)常用技術(shù)，附錄3A放射自顯影附錄3B玻璃器皿的硅化附錄3C透析與超濾附錄3D用吸收光譜法和熒光光譜法定量DNA和RNA附錄3E通過沉默突變引入限制性酶切位點附錄4試劑和設(shè)備的供應(yīng)商附錄5參考文獻致謝